液氮研磨组织操作方法

液氮研磨是一种利用液氮（-196°C）的极低温度使生物组织瞬间脆化，再通过机械力将其粉碎成精细粉末的物理方法。它在分子生物学、蛋白质组学、代谢组学等研究中至关重要，能有效防止样本降解并提高分子提取效率。以下是详细操作步骤与关键注意事项：

一、实验目的

• 快速、高效地粉碎新鲜或冷冻的生物组织（动物、植物、微生物）。

• 最大限度保持组织内核酸、蛋白质、代谢物等目标分子的完整性和活性。

• 抑制内源性酶活（如RNases、DNases、蛋白酶），减少降解。

• 为后续的核酸/蛋白质提取、代谢物分析等提供均质化的起始材料。

二、实验原理

液氮的极低温使组织中的水分瞬间结晶，导致组织物理结构变得极其脆弱（“低温脆化”）。此时施加机械研磨力，脆化的组织很容易被粉碎成细小的颗粒或粉末。整个过程在低温下快速进行，显著降低了热敏性分子降解的风险。

三、所需材料与设备

1. 核心设备：

• 研钵与研杵： 最好使用厚重、专为低温设计的玛瑙研钵或不锈钢研钵（耐低温冲击）。研杵应匹配研钵大小。

• 液氮罐/杜瓦瓶： 用于储存和倾倒液氮，需有良好保温性能。

• 保温盒/泡沫盒： 用于盛放研钵并临时存放液氮，提供操作平台，减少液氮快速挥发。

2. 样品与耗材：

• 待研磨组织样本： 新鲜组织或保存在-80°C的组织（取出后立即处理）。

• 液氮： 足量。

• 预冷的样品管/离心管： 用于收集研磨好的粉末（推荐1.5mL或2mL离心管，提前置于冰上或-80°C预冷）。

• 预冷的药勺/刮刀： 用于转移粉末。

• 镊子/剪刀： 用于处理组织块。

3. 防护装备（至关重要！）：

• 低温防护手套： 专用液氮操作手套或厚实的皮/棉手套（切勿使用普通乳胶/丁腈手套，无法防冻伤）。

• 实验服/防护服： 保护身体。

• 护目镜/面罩： 防止液氮飞溅入眼。

• 防冻鞋/封闭鞋子： 保护脚部。

• 长裤。

4. 其他：

• 记号笔（标记样品管）。

• 冰盒/干冰。

• 通风良好的操作空间。

四、操作步骤详解

1. 准备工作：

• 佩戴防护装备： 务必戴好低温手套、护目镜/面罩、穿好实验服和长裤、防冻鞋。

• 环境准备： 确保操作区域通风良好（避免液氮气体积聚导致缺氧），清洁干燥，无杂物。

• 预冷设备： 将研钵和研杵放入保温盒中。缓慢、少量地倒入液氮，直至研钵底部被覆盖。让研钵和研杵在液氮中浸泡预冷数分钟（至少3-5分钟）。研杵可用镊子夹住浸入液氮。注意： 倾倒液氮时动作要慢，防止剧烈飞溅。

• 组织准备： 将新鲜组织切成尽可能小的块（< 0.5 cm³），或从-80°C冰箱取出冷冻组织块（避免解冻）。若组织块太大，可先置于液氮中速冻几秒使其硬化，再用预冷的研钵或锤子敲碎成小块。

2. 预冷研磨：

• 用预冷的镊子小心夹取一小块组织（不要一次研磨太多组织，避免研钵温度快速上升）。

• 将组织块迅速投入预冷好的研钵中。组织块接触液氮会剧烈沸腾（属于正常现象）。

3. 初步破碎：

• 迅速用预冷的研杵垂直、轻柔但有力地敲击组织块。此时组织因低温脆化，很容易碎裂成较小的颗粒。注意： 避免剧烈敲击导致组织粉末飞溅出研钵或液氮剧烈喷溅。

4. 持续研磨：

• 关键操作： 当研钵内的液氮几乎挥发完（沸腾停止或很少），组织颗粒开始有变软或粘连趋势时，立即、少量地沿研钵壁缓缓加入新的液氮（避免直接倒在粉末上引起飞溅）。再次淹没组织颗粒。

• 待液氮平稳（沸腾减弱）后，用研杵用力、快速、画圈研磨（像碾药一样）。利用研杵与研钵壁的挤压和摩擦力将颗粒磨细。

• 重复“液氮挥发 -> 少量添加液氮 -> 用力研磨”的循环过程，直至组织被研磨成细腻、均匀、干燥的粉末状（通常需要添加液氮3-6次，具体次数取决于组织量和韧性）。

5. 收集样品：

• 当最后一次加入的液氮几乎完全挥发（粉末呈干燥蓬松状，无可见液体或冰晶），但粉末仍处于极低温状态时（这是防止复温降解的关键！），迅速用预冷的药勺或刮刀将粉末刮起。

• 立即将粉末转移至预冷的样品管/离心管中。

• 迅速盖紧管盖，并立即置于液氮、干冰或-80°C冰箱中保存，或立即进行下一步提取操作。

6. 清理：

• 让残留液氮在通风处自然挥发完全。

• 用纯水或适当的溶剂清洗研钵和研杵，彻底干燥后存放。

• 妥善处理废弃物。

五、关键注意事项与安全警示

1. 安全第一（重中之重！）：

• 严防冻伤： 液氮温度极低，皮肤直接接触会造成严重冻伤（类似烫伤）。务必全程佩戴合格的低温防护手套、护目镜/面罩，穿好防护服、长裤和防冻鞋。 避免皮肤任何部位暴露。

• 防止窒息： 液氮气化会迅速膨胀（体积膨胀约700倍），大量挥发可能置换空气导致局部缺氧。必须在通风良好的环境中操作！ 切勿在密闭小空间使用大量液氮。

• 防爆沸/飞溅： 向研钵添加液氮时，务必缓慢、少量、沿壁加入。热的物体或水进入液氮会引发剧烈沸腾和飞溅，极其危险。确保所有接触液氮的器具（研钵、研杵、镊子、药勺、样品）完全干燥无水！

• 防容器胀裂： 绝对禁止将液氮密封在任何容器中（如拧紧盖子的离心管）。气化产生的巨大压力会导致容器爆炸。

• 轻拿轻放： 处理盛有液氮的容器要小心，避免剧烈震动或倾倒。

2. 操作效率与样品质量：

• 组织量适中： 一次研磨的组织量不宜过多（通常< 100mg - 1g，视研钵大小定），否则难以磨匀且研钵升温快。

• 保持低温： 研磨过程中要密切观察液氮量，在组织粉末未复温软化前及时补充液氮。一旦粉末变湿、结块或变粘，表明温度已升高，分子降解风险剧增。

• 快速转移： 粉末收集动作要极其迅速，在粉末仍处于超低温干燥状态时完成转移和冷冻保存。

• 预冷一切： 研钵、研杵、镊子、药勺、样品管都必须充分预冷，减少热量引入。

• 组织特性： 脂肪含量高或纤维特别坚韧的组织更难研磨，可能需要更多次液氮添加和更大力道。

3. 设备选择：

• 研钵和研杵应足够厚重以承受低温冲击和研磨力，玛瑙最佳（惰性、耐磨），不锈钢次之。避免使用薄壁玻璃研钵（易碎）。

六、应用范围

• 提取高质量总RNA、mRNA（尤其防止RNase降解）。

• 提取基因组DNA、质粒DNA。

• 提取总蛋白、磷酸化蛋白等，用于Western Blot、质谱分析。

• 提取代谢物，用于代谢组学分析。

• 制备均质化的组织样品用于酶活性测定、小分子分析等。

总结： 液氮研磨是破坏坚硬生物组织、获取高质量生物分子的强大工具，但其核心在于安全操作和全程维持低温。熟练掌握“少量组织、充分预冷、及时补氮、快速研磨、低温转移”的要领，并严格遵守安全防护规范，是成功进行液氮研磨实验的关键。对于通量要求高的实验室，也可考虑使用自动化的冷冻研磨仪（球磨仪），但手动液氮研磨在灵活性、成本和控制精细度上仍有其独特优势。